Detection and quantification of environmental chlamydiae and their hosts using digital droplet PCR and fluorescence-activated cell sorting

Es ist mittlerweile gut belegt, dass freilebende Amöben als Wirte für eine Vielzahl unterschiedlicher Mikroorganismen, einschließlich zahlreicher Krankheitserreger, fungieren. Mitglieder des Phylums Chlamydiota zählen zu den bedeutendsten bakteriellen Endosymbionten dieser Eukaryoten. Trotz ihres weltweiten Vorkommens in verschiedensten Wirten – von Amöben über andere Protisten bis hin zu den bekannten humanpathogenen Vertretern Chlamydia trachomatis und Chlamydophila pneumoniae – sind viele Aspekte von Umweltchlamydien bislang unzureichend erforscht. Insbesondere Fakten über ihre Abundanz in natürlichen Habitaten und ihre Kultivierbarkeit stellen nach wie vor zentrale Wissenslücken dar. Ziel dieser Arbeit war es daher, methodische Ansätze zu entwickeln und zu optimieren, die 1.) eine schnelle und präzise Quantifizierung sowie 2.) einen gezielten Nachweis und potenziell auch die Kultivierung von Umweltchlamydien ermöglichen, um so zu einem tieferen Verständnis dieser Bakterien beizutragen. Als Modell wurden Protochlamydia amoebophila in Symbiose mit Acanthamoeba castellanii kultiviert. Darauf aufbauend wurden verschiedene Verfahren zur Zellfärbung und Zellsortierung evaluiert sowie ein Protokoll zur Quantifizierung von Chlamydien in Umweltproben mittels digitaler Tröpfchen-PCR (digital droplet PCR, ddPCR) etabliert. Die ddPCR, welche eine absolute Quantifizierung erlaubt, erwies sich als vielversprechende Methode für einen umfassenderen Nachweis von Chlamydiae in Umweltproben. Sie bietet gegenüber herkömmlichen Verfahren den Vorteil einer höheren Nachweisempfindlichkeit insbesondere für seltene Sequenzen und niedriger Gen Kopien und ist zudem weniger anfällig für Inhibitoren und unspezifische Signale. Ergänzend wurden verschiedene Färbemethoden getestet, darunter FISH in Suspension, die Färbung von Nukleinsäuren mittels DAPI und SYTO™9, die Lysosomenmarker LysoTracker™ Red und Yellow sowie die fluoreszierenden D-Aminosäuren (FDAAs) HADA und BADA. Diese Färbeverfahren wurden hinsichtlich ihrer Eignung zur Identifikation von Chlamydiae-infizierten Protisten aus Umweltproben in Kombination mit einem BD FACSMelody™-Zellsortierer untersucht. Ein robustes ddPCR-Protokoll zur exakten Quantifizierung von P. amoebophila wurde erfolgreich etabliert und erfolgreich mit Umweltproben getestet. Darüber hinaus wurde ein effizientes FISH-in-Suspension-Protokoll speziell für mit P. amoebophila infizierte A. castellanii entwickelt, das auch für FACS-gestützte Analysen geeignet ist. Die Evaluierung der Färbemethoden zeigte, dass einzelne Ansätze in der Regel erfolgreich waren, während sich kombinierte Anwendungen des Öfteren gegenseitig inhibierten. In ersten Versuchen konnten aus Umweltproben, die mittels FISH in Suspension und FACS sortiert wurden, auch Protisten erfolgreich kultiviert werden und mittels Sequenzierung charakterisiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sowohl ddPCR als auch FACS-basierte Nachweisstrategien bereits praxistauglich sind und ein hohes Potenzial für weiterführende Untersuchungen von Chlamydien in der Umwelt besitzen.