Étude de cinétique enzymatique par D-DNP : développements méthodologiques et application à la métabolomique

L'étude du métabolisme cellulaire et de la cinétique enzymatique est essentielle pour comprendre la fonction cellulaire. La plasticité enzymatique permet à la cellule d'adapter ses voies métaboliques aux variations de l'environnement, assurant ainsi son homéostasie. Plus de 500 maladies métaboliques, dues à des dysfonctionnements enzymatiques affectant diverses voies, sont actuellement recensées. L'analyse des réseaux métaboliques et de leurs interconnexions offre une approche prometteuse pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Un exemple notable est la sclérose en plaques, où la biotine, cofacteur de plusieurs enzymes, améliore l'état clinique. Il est donc crucial de décrire précisément les flux métaboliques et leur régulation. Les approches fluxomiques visent à modéliser ces voies par des méthodes numériques, afin de mieux appréhender les conséquences de leur perturbation. Pour cela, il est nécessaire de caractériser les cinétiques enzymatiques dans des conditions physiologiques. Nous proposons d'explorer ces cinétiques par spectroscopie RMN (résonance magnétique nucléaire), une méthode puissante et polyvalente largement utilisée en recherche et en industrie. La RMN permet d'étudier la structure et la dynamique moléculaire, et notamment de suivre l'évolution temporelle de réactions chimiques, en observant simultanément substrats et produits. Cependant, une limite majeure de la RMN réside dans sa faible sensibilité, due à la très faible polarisation des spins nucléaires à l'équilibre thermique, même dans les champs magnétiques les plus puissants (> 23 T). À température ambiante, cette polarisation est de l'ordre de 10⁻⁴, ce qui rend l'étude de processus rapides (< 60 s) difficile. Pour pallier cette limite, des techniques d'hyperpolarisation ont été développées, notamment la polarisation nucléaire dynamique (DNP), et plus spécifiquement sa version en solution, la DNP de dissolution (D-DNP), qui est au cœur de ce projet. La D-DNP peut amplifier le signal RMN de plus de quatre ordres de grandeur. Depuis son développement, cette technique a donné lieu à de nombreux progrès instrumentaux et à diverses applications, notamment dans le domaine de la santé. Une expérience D-DNP comprend plusieurs étapes : (i) hyperpolarisation nucléaire à très basse température (~1,2 K) via irradiation micro-ondes d'impuretés paramagnétiques (appelées agents polarisants) ; (ii) dissolution de l'échantillon par injection d'un solvant chauffé (~180 °C) ; (iii) transfert rapide vers un spectromètre RMN via un circuit sous pression d'hélium ; (iv) acquisition de spectres RMN sur l'échantillon hyperpolarisé. Cette dernière étape est répétée pour suivre l'évolution temporelle du système. La D-DNP permet ainsi d'observer des réactions enzymatiques rapides in vitro, à des échelles de temps physiologiques, en injectant un substrat hyperpolarisé dans une solution enzymatique directement dans le spectromètre. Grâce à la sensibilité accrue, il est possible d'acquérir un spectre RMN toutes les 500 ms à 1 s, offrant une résolution temporelle bien supérieure aux techniques conventionnelles. En particulier pour le 13C, qui requiert habituellement des accumulations de spectres pour atteindre un bon rapport signal/bruit, la D-DNP permet d'observer des cinétiques en temps réel, ce qui est généralement impossible autrement. Ce projet s'inscrit dans un champ de recherche particulièrement dynamique : l'étude des cinétiques enzymatiques dans des conditions pseudo-physiologiques, avec des perspectives importantes pour la compréhension des mécanismes biologiques et l'exploration de nouvelles stratégies thérapeutiques.