Heterologe Expression des Lipase-Gens in Cereibacter sphaeroides 2.4.1, gesteuert durch einen anaeroben, photosyntheseinduzierbaren Promotor

• Das T1.2RQ-Lipase-Gen wurde erfolgreich im photosynthetischen Bakterium Cereibacter sphaeroides exprimiert, wodurch dieser Organismus als tragfähige und potenziell energieeffiziente Plattform zur Produktion rekombinanter Enzyme etabliert wurde. • Der puf-Promotor (sauerstoffreguliert) zeigte unter anaeroben photoheterotrophen Bedingungen eine überlegene Leistung im Vergleich zum lac-Promotor, was seine Effektivität für eine hochgradige Expression bei niedriger Sauerstoffspannung bestätigt. • Die exprimierte T1.2RQ-Lipase wies eine hohe Thermostabilität (optimal bei 65 °C) und Aktivität an langkettigen Substraten auf, geeignet für industrielle Anwendungen. Cereibacter sphaeroides 2.4.1, ein purpurnes schwefelfreies Bakterium, ist ein stoffwechselmäßig vielseitiger Organismus, der zwischen aerober Atmung und anaerober photoheterotropher Ernährung wechseln kann. Diese Anpassungsfähigkeit macht ihn zu einer attraktiven Plattform für nachhaltige Biokatalyse, die Sonnenenergie nutzt, um energiereiche biochemische Reaktionen anzutreiben. In dieser Studie evaluierten wir C. sphaeroides als heterologen Expressionswirt für die thermostabile T1.2RQ-Lipase von Geobacillus stearothermophilus T1.2 unter Verwendung des Breitband-Wirtsvektors pRK415. Zur Nutzung lichtreaktiver Regulation wurde die Expression, die vom anaeroben/mikroaeroben-induzierbaren puf-Promotor angetrieben wird, mit der vom konstitutiven lac-Promotor getriebenen Expression verglichen. Unter anaeroben Bedingungen überstieg die puf-gesteuerte Expression (0,333 ± 0,044 U/mg) die lac-gesteuerte Expression (0,108 ± 0,01 U/mg), während unter aeroben Bedingungen der lac-Promotor eine höhere Aktivität (0,542 ± 0,001 U/mg) als der puf-Promotor (0,247 ± 0,010 U/mg) erzielte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung eines indigenen Promotors nicht notwendigerweise mit proportionalen Steigerungen der Enzymausbeute korreliert. SDS–PAGE- und Zymogrammanalysen bestätigten die Expression des rekombinanten Enzyms und zeigten eine konstante Molekularmasse von ca. 43 kDa. Die Lipase zeigte eine optimale Aktivität bei 65 °C und behielt nach 3 Stunden bei 50 °C ca. 70 % der Aktivität. Die maximale Aktivität wurde bei pH 10,0 erreicht, und das Enzym blieb zwischen pH 7,0–10,0 stabil, wobei > 75 % der Restaktivität nach 180 Minuten erhalten blieben. Substratspezifitätsuntersuchungen zeigten Aktivität gegenüber mehreren p-Nitrophenylestern mit einer Präferenz für kurzkettige Substrate, insbesondere pNP-Butyrat. Insgesamt identifizieren diese Ergebnisse den puf-Promotor als vielversprechendes Regulator-Element für lichtgetriebene Proteinexpression in C. sphaeroides. Die Kopplung der Enzymproduktion an den photosynthetischen Stoffwechsel bietet eine energiearme Strategie für industrielle Biokatalyse.