Design, Validierung und Implementierungsüberlegungen für artengezielte Umwelt-RNA-Analysen zur Erkennung von Präsenz und physiologischen Zuständen

ZUSAMMENFASSUNG Umwelt-RNA (eRNA) erweist sich als vielversprechendes Werkzeug zur Erkennung von Artenpräsenz und/oder physiologischen Zuständen in der Biodiversitätsüberwachung, Ökotoxikologie und Naturschutz. Im Vergleich zu Umwelt-DNA (eDNA) ist die Optimierung von eRNA-Analysprotokollen relativ unentwickelt, und der Konsens unter den Forschern ist begrenzt. Während das Design und die Implementierung von eRNA-Assays viele Gemeinsamkeiten mit eDNA-Assays aufweisen, sind zusätzliche wichtige Überlegungen erforderlich für spezifische und empfindliche eRNA-Assays, um falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse zu minimieren. Wir prüfen diese kritisch im aktuellen Kontext für gezielte Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Die Auswahl der RNA-Ziele sollte von den spezifischen Zielen des eRNA-Assays geleitet werden und muss die Entfernung von genomischer DNA (gDNA) und die Umwandlung von RNA in cDNA vor der qPCR-Analyse berücksichtigen. Dazu gehört die Berücksichtigung des RNA-Typs und der Herkunft; ob die gemessene RNA als physiologischer Indikator für die Gesundheit, den Stress oder demografische Muster von Organismen wirkt; ob die RNA als Indikator für die Präsenz fungiert; oder ob die RNA ein Normalisierer für die physiologischen Indikatoren ist. Das Design von Primer-Probe sollte, wenn möglich, Exon-Exon-Grenzen überspannen, um gDNA-Amplifikation zu minimieren. Wenn dies nicht möglich ist, sind für jede Probe minus Reverse-Transkriptase (RT-) Reaktionen erforderlich. Eine rigorose Assay-Validierung beginnt mit In-silico-Screenings gegen Ziel- und Nicht-Ziel-Taxa-Transkriptsequenzen, gefolgt von In-vitro-Tests mit cDNA, die aus RNA und gDNA-Extrakten von Voucher-Proben erzeugt wurde. Die Benchmarking-Sensitivitätsbewertung durch Maße wie Nachweisgrenze (LOD), Quantifizierungsgrenze (LOQ) und Amplifikationseffizienz stärkt das Vertrauen in den Assay. Die Feldvalidierung von eRNA-Assays unter Verwendung von Umweltproben, bei denen Zielarten vorhanden und abwesend sind und/oder sich in einem gewünschten physiologischen Zustand befinden (z. B. Kontaminanten ausgesetzt sind), hilft, falsch-positive und falsch-negative Raten zu schätzen. Wir prüfen die aktuellen eRNA-Praktiken kritisch und geben Richtlinien und Vorschläge für ein robustes Design und die Implementierung von eRNA-Assays.