BINDSCAN: a computational protocol for the engineering of glycoside hydrolases

L'enginyeria enzimàtica ha revolucionat l'expansió de les funcions enzimàtiques naturals, permetent el desenvolupament de nous biocatalitzadors amb propietats ajustables per a diverses aplicacions. Aquesta tesi es centra en avançar les metodologies computacionals per optimitzar el rendiment enzimàtic, especialment per a l'enginyeria de glicosil hidrolases (GH). Les GH catalitzen la ruptura hidrolítica de l'enllaç glicosídic en glicans i glicoconjugats. En els darrers anys, s'han fet esforços per reconduir la funció enzimàtica de les GH cap a l'activitat de transglicosidació per catalitzar la síntesi d'enllaços glicosídics per a la producció de carbohidrats d’alt valor afegit. Aquesta tesi té com a objectiu ampliar les capacitats de predicció de BINDSCAN, un protocol computacional per a l'enginyeria de proteïnes desenvolupat originalment al Laboratori de Bioquímica de l'IQS School of Engineering. El protocol es basa en l'anàlisi mutacional massiva de la seqüència de proteïna per a la identificació de posicions sensibles al reconeixement de lligands. En aquesta tesi hem: i) implementat noves mètriques basades en mesures d'afinitat d'enllaç i càlculs de potencial electrostàtic, ii) optimitzat el rendiment computacional, iii) implementat una interfície gràfica per a l'anàlisi de resultats i iv) aplicat la nova versió del protocol a diferents GH d'interès. Hem demostrat que les GH han evolucionat per generar un gradient de potencial electrostàtic al seu centre actiu complementari a la separació de càrregues desenvolupada a l'enllaç glicosídic hidrolitzable durant la catàlisi. Això ens ha permès desenvolupar una nova mètrica electrostàtica capaç d'identificar residus crucials per estabilitzar l'estat de transició de la reacció. La mètrica s'ha utilitzat pel cribratge de diferents GH: i) Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanasa (BlβGluc), ii) Thermobacillus xylanilyticus α-L-arabinofuranosidasa (TxAbf), iii) Spodoptera frugiperda β-glicosidasa (SfβGly) i Bifidobacterium bifidum lacto-N-biosidasa (BbLnbB). Els resultats han demostrat que aquesta mètrica prediu eficaçment les posicions que afecten a l'activitat hidrolítica com ara M58A a BlβGluc, R69H a TxAbf i W394F a BbLnbB. A més, hem validat el rendiment de classificació de les diferents mètriques del protocol BINDSCAN contra dades experimentals massives de SfβGly. També proposem una estratègia computacional basada en el protocol BINDSCAN per guiar el disseny de transglicosidases eficients millorant la unió de la molècula acceptora i dificultant l'activitat hidrolítica natural. Les campanyes de cribratge sobre TxAbf i BbLnbB han demostrat la capacitat del protocol per identificar variants de GH amb alts rendiments de transglicodilació: TxAbf R69H (7,3%) i BbLnbB W394F (32%), H263A (21%). Aquesta tesi contribueix a escurçar la distància entre el disseny teòric i la validació experimental per ampliar les capacitats de l'enginyeria enzimàtica per a aplicacions industrials i biotecnològiques.