Development of FiCAT gene writing tool for ex vivo engineering of Hematopoietic Stem & Progenitor Cells (HSPCs). Safe implementation and detailed molecular characterization for pre-clinical therapeutic applications

A Integra Therapeutics, hem desenvolupat FiCAT (Find and Cut-and-Transfer), una innovadora tecnologia d’edició genòmica que combina la precisió de CRISPR/Cas amb una transposasa piggyBac modificada per a la inserció eficient i específica de fragments d’ADN grans i menuts. Aquesta tesi es centra en l’aplicació ex vivo de FiCAT en cèl·lules primàries, especialment en Cèl·lules Mare i Progenitores Hematopoètiques (HSPCs), mitjançant els formats basats en ribonucleoproteïna (RNP) i ARNm. L’eina ha sigut optimitzada amb el desenvolupament de FiCAT split, separant els mòduls de la transposasa i Cas per a millorar el lliurament i l’eficiència. La validació funcional es va dur a terme mitjançant expressió del transgen (citometria de flux), PCRs de la unió per a confirmar la integració dirigida, i tècniques NGS (INSERT-seq i anàlisi d’indels). La caracterització molecular es va realitzar en línia cel·lular C2C12 abans de l’aplicació en HSPCs, on s’avaluaren eficiència i toxicitat. També es validaren càrregues terapèutiques mitjançant estratègies de gene trap. Aquest treball demostra el potencial de FiCAT per a una edició genòmica segura i precisa per a aplicacions terapèutiques.