Ribosomale Dimerisierungsfaktoren spielen eine zentrale Rolle in der Regulation der Translation in Organismen. Während die Dimierisierungsvorgänge der Ribosomen in Bakterien und Eukaryoten gut erforscht sind, ist deren Funktion in Archaeen noch nicht genau bekannt. Ziel dieser Studie war es, einen Deletionsstamm von Pyrococcus furiosus zu erzeugen, bei dem der ribosomale Dimerisierungsfaktor PF0560 der Archaeen fehlt, um seine Funktion in diesem Organismus zu untersuchen. Dieses Protein ist für Bildung eines 30S-30S-Dimers unter Nahrungsmangelbedingungen verantwortlich und spielt hierbei eine wichtige Rolle bei der Regulation der Ribosomen im Zuge der Translation in Archaeen. Zudem könnte PF0560 in Pyrococcus furiosus, einem Organismus, der unter extrem hohen Temperaturen gedeiht, eine zentrale Rolle bei der Regulierung der energieintensiven Translation übernehmen. Dies könnte den Organismen eine Strategie zur Überlebenssicherung unter extremen Bedingungen bieten. Da die genau Rolle noch nicht bekannt ist, wie dieser Faktor Ribosomen in ihrer Funktion beeinflusst, ist die Forschung der ribosomalen Faktoren in Archaea essentiell. Um daher mehr Einblicke in die funktionelle Rolle des ribosomalen Dimerisierungsfaktors (aRDF) der Archaeen zu gewinnen, wurde das Protein im Zuge dieser Arbeit im Organismus deletiert und das Wachstum diese resultiereten Mutante analysiert. Hierbei wurde eine Deletionsstrategie verwendet, die ein genetisches Manipulationssystem ermöglichte. Grundlage dieser Strategie war die homologe Rekombination, bei der das Gen pf0506 mittels eines Doppel-Crossover ausgetauscht wurde. Hierzu wurden die Regionen, die den aRDF ,codiert durch pf0560, flankieren, amplifiziert und mit einem für Pyrococcus furiosus essentiellen Gen verbunden. Das zusammengesetzte Konstrukt wurde in eine auxotrrophe Mutante eingeführt, dem dieses essentielle Gen fehlt und für das Wachstum der hyperthermophilen Archaeen entscheidend ist. Auf diese Weise wurden homologe Regionen flankierend um den aRDF bereitgestellt, die mit dem essentiellen Gen an der Stelle des aRDF verknüpft waren. Nach der Transformation konnte ein Doppel-Crossover an den homologen Regionen stattfinden, der zum Austausch von pf0560 durch das essentielle Gen führte. Mit dieser Strategie konnten positive Transformanten direkt anhand ihres Wachstums identifiziert werden. In der weiteren Arbeit wurde die Deletionsmutante im Wachstum überwacht und es konnte beobachtet werden, dass der ribosomale Dimierisierungsfaktor eine wichtige Rolle bei der Stabilität der Zellen spielt, insbesondere in der stationäre Phase. Darüber hinaus wurde dieses Deletionssystem in dieser Arbeit verwendet, um ein kleineres ribosomales Protein in Pyrococcus furiosus zu deletieren. Hierbei sollte das ribosomale Protein L41e, das als ribosomales Protein in mehreren Lebensbereichen verbreitet ist, in Pyrococcus furiosus entfernt werden. Das Protein L41e ist dafür bekannt, mit der 50S-Untereinheit der Ribosomen zu interagieren und spielt eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der Kontakte zwischen verschiedenen ribosomalen Proteinen und rRNA-Regionen. Insbesondere beeinflusst das Protein die Effizienz der Proteinsynthese. Da die Funktion von L41e in anderen Lebensdomänen besser bekannt ist, bleibt allerdings die essentielle Rolle von L41e in Archaeen bislang unklar. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit das Protein L41e in Pyrococcus furiosus deletiert, um seinen Einfluss in Archaeen zu untersuchen. Auch hierbei wurde das genetische Deletionssystem verwendet, basierend auf der Erzeugung von homologen Regionen stromauf- und stromabwärts von L41e in der auxotrophen Mutante. Durch Verbinden der upstream- und downstream-Regionen von L41e mit dem essentiellen Gen sollte L41e mittels homologer Rekombination deletiert werden. Allerdings konnte L41e mit diesem Ansatz nicht entfernt werden. Dies deutet darauf hin, dass L41e in Archaeen möglicherweise eine wesentlichere Rolle spielt als bisher angenommen. Auf Basis dieser Studie wird daher deutlich, wie notwendig die Forschung an Archaeen und deren ribosomalen Proteinen ist, um die Mechanismen zu verstehen, die diesen Organismen das Leben unter extrem unterschiedlichen Bedingungen ermöglichen.
Michaela Mach (Thu,) studied this question.