Diferenciación de rickettsias del grupo de fiebre manchada mediante secuenciación y análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción de ADN amplificado por PCR del gen que codifica la proteína rOmpA

Actualmente, la identificación genotípica de las rickettsias del grupo de fiebre manchada (SFG) se basa en el análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción de genes amplificados por PCR que codifican para la enzima citrato sintasa y las proteínas de superficie rOmpA y rOmpB. Se encontró un conjunto de endonucleasas de restricción útiles tras la comparación de las secuencias de Rickettsia rickettsii y R. prowazekii. Sin embargo, utilizando tres amplificaciones de PCR y cuatro digestiones enzimáticas con este conjunto, fue imposible diferenciar entre todos los serotipos conocidos de las rickettsias del SFG. Amplificamos por PCR y secuenciamos utilizando un secuenciador automático láser fluorescente un fragmento del gen que codifica la proteína rOmpA de 21 serotipos de las rickettsias del SFG. Se obtuvo un producto de amplificación de 632 pb para la mayoría de las cepas, aunque no se pudo obtener producto utilizando ADN de R. akari, R. australis, R. helvetica y R. bellii. Encontramos una secuencia característica para todas las cepas estudiadas, excepto para los dos aislados de R. massiliae, los aislados GS y Mtul. Usando el paquete de software BISANCE, determinamos el mapa de restricción de este fragmento e identificamos cinco endonucleasas potencialmente útiles: RsaI, AluI, PstI, XbaI y AvaII. Confirmamos los perfiles derivados del análisis por computadora mediante el análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de restricción de PCR. La combinación de los perfiles obtenidos tras la digestión del producto de PCR por RsaI y PstI permitió diferenciar 16 cepas. El uso de AluI y XbaI permitió caracterizar respectivamente a R. parkeri y a la cepa HA-91. R. africae y la cepa S fueron diferenciadas por digestión con AvaII. Así, utilizando una única amplificación de PCR, pudimos diferenciar todas las rickettsias del SFG cuyos genes ompA fueron amplificados por PCR.