Die Messung der Proteinabundanz in Zellen mittels Proteomischer Techniken ermöglicht die Proteomweite Bestimmung von Protein Halbwertszeiten. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu entwickeln, die eine robuste und reproduzible Bestimmung von Halbwertszeiten erlaubt. Die Methode wird angewendet, um Proteom-weite Veränderungen in der Protein Abbaurate zu bestimmen, die aufgrund einer Behandlung mit Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) auftreten. PROTACs sind heterobifunktionelle Moleküle, die sehr spezifisch Proteine in Zellen und Geweben abbauen. Dabei nutzen PROTACs das körpereigene Ubiquitin-Proteasom System aus, das generell für den Großteil des Proteinabbaus im Körper verantwortlich ist. Der durch PROTACs induzierte Protein Abbau wird meistens durch Endpunkt Perturbationsexperimente bewiesen. Diese Art von Experimenten ermöglicht es jedoch nicht, den durch die PROTAC Behandlung verursachten Anteil am Proteinabbau vom Körpereigenen Anteil zu unterscheiden. Die Grundvermutung lautet, dass PROTACs die Halbwertszeiten einer großen Anzahl von Proteinen beeinflussen. Um die Vermutung überprüfen zu können, wurde zuerst ein Zellkultur Modellsystem in einem metabolischen Gleichgewichtszustand ausgewählt, das alle für die PROTAC Funktion notwendigen Proteine in ausreichender Abundanz exprimiert. Mit Phorbol myristat acetat (PMA) differenzierte HL-60 Leukämie Zellen wurden als Modellsystem ausgewählt. Der metabolische Gleichgewichtszustand ermöglicht die Messung des Proteinabbaus, ohne dass Faktoren wie eine nicht einheitliche Verteilung des Zellzyklus oder Zellzyklus abhängige Änderungen der Proteinexpression beachtet werden müssen. Methodische Parameter, wie die Länge des chromatographischen Gradienten, die Datenbank Suchparameter und die Behandlungskonzentrationen, wurden an das ausgewählte Modellsystem angepasst und für die Protein Halbwertszeit Bestimmung optimiert. Ein 140 Minuten langer Gradient, sowie ein auf einem einzigartigen Peptid basierten Datenbank Suchparameter wurden im Rahmen der Versuche angewendet, um die Anzahl der identifizierten Proteine zu maximieren. Ein auf Zeitreihen basierender Versuch hat es ermöglicht, den Einfluss zwei verschiedener PROTAC Behandlungen auf Protein Halbwertszeiten zu identifizieren. Im Rahmen der Zeitreihen wurde die Cycloheximid chase Methode erfolgreich angewandt, wobei gleichzeitig mit der PROTAC Behandlung eine Inhibition der Protein Neusynthese mittels einer 10 µM Cycloheximid Konzentration erfolgte. Der Abfall der Proteinabundanz nach der Behandlung wurde über acht Stunden verfolgt. Die baseline Protein Abbaurate im Modellsystem wurde in einem weiteren Experiment mit ausschließlicher Cycloheximid Behandlung ermittelt. Weiters wurde das Proteasom mit Bortezomib inhibiert, um den PROTAC induzierten Abbau von Zielproteinen zu verifizieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine in vitro Methode zur Messung von Proteom-weiten Protein Halbwertszeiten erfolgreich entwickelt. Weiters wurde zum Ersten Mal die Aktivität von PROTACs mittels Messung des Protein Abbaus gemessen. Der effiziente Abbau von den, aus Literatur bekannten, SMARCA2 und PBRM1 Zielproteinen konnte für die ACBI2 PROTAC bestätigt werden. Die Inhibition des Proteasoms mittels Bortezomib hatte keinen Einfluss auf den Abbau der Zielproteine der PROTAC. Die experimentelle, Gold basierte metallo-PROTAC konnte das erwartete Zielprotein TXNRD1 nicht abbauen. Ein stringentes Filtern der experimentell nachgewiesenen Proteine hat gezeigt, dass der Median der Protein Halbwertszeiten im Kontrollzustand (44 IDs, 15 Stunden) höher war als mit Cycloheximid Behandlung (133 IDs, 11.53 Stunden). Weiters waren die Median Halbwertszeiten sowohl bei gleichzeitiger Cycloheximid, ACBI2 PROTAC Behandlung (320 IDs, 13.32 Stunden) als auch bei simultaner Cycloheximid, Gold PROTAC Behandlung (166 IDs, 10.54 Stunden) geringer als im Kontrollzustand. Das Experiment ermöglichte die Identifizierung von Proteinen mit experimentellen Halbwertszeiten unter 20 Stunden. Zudem ermöglichte das Experiment PROTAC spezifische Auswirkungen auf die Halbwertszeit von jenen Proteinen zu ermitteln, die sowohl in Cycloheximid als auch in Cycloheximid PROTAC Zuständen identifiziert wurden. Die Gold PROTAC Behandlung führte zu geringeren Halbwertszeiten bei 78% der Proteine deren Halbwertszeit in beiden Bedingungen identifiziert wurden. Die ACBI2 PROTAC Behandlung führte zu niedrigeren Halbwertszeiten in 71% der Proteine, die in beiden Bedingungen identifiziert wurden. Dies beweist, dass PROTACs einen Effekt auf einen weitaus größeren Pool an Proteinen ausüben als eigentlich erwartet. Diese Erkenntnis stellt einen weiteren wichtigen Baustein zum besseren Verständnis des Wirkmechanismus dieser Verbindungen dar.
Thomas Iellici (Wed,) studied this question.