Accessing flexibly modified prion protein variants by combining genetic code expansion and protein semi-synthesis

Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Kombination der Techniken der Expansion des Genetischen Codes (GCE), der Exprimiertes Protein Selenoester Ligation (EPSL) als auch der Kupfer katalysierten Azid Alkin Cycloaddition (CuAAC) um flexibel modifizierte Volllängenvarianten des Rötelmaus Prion Proteins (bvPrP) zu erhalten. Die Weiterentwicklung dieser Techniken wird die Herstellung von mg-Mengen homogener bvPrP Varianten mit Glykanmimetika sowie einem C-terminalem Glycosylphosphatidylinositol (GPI) Mimetikum erlauben, um deren Effekt auf PrP Faltung, Aggregation und pathologischen Ereignissen in Zellen zu erforschen. In dieser Arbeit wurden die zwei nativen N-Glykosilierungsstellen an den Positionen 181 und 197 in der bvPrP Aminosäuresequenz individuell mit einem Amber-Stopcodon substituiert, was die positionsspezifische Einführung von nicht-kanonischen Aminosäuren (ncAAs) wie N-ε-((2-azidoethoxy)carbonyl)-L-Lysin (AzK) und N-ε-(prop-2-inyloxycarbonyl)-L-Lysin (YnK) ermöglicht. YnK von kommerziellen Quellen wurde verwendet, sowie aufgrund von ökonomischen Gründen selbst synthetisiert. Beide Chargen wurden erfolgreich angewandt. Während dem Verlauf dieser Arbeit wurden vier unterschiedliche bvPrP Inteinfusionsproteinvarianten, nämlich bvPrP-WT, bvPrP-N181X-AzK, bvPrP-N197X-AzK und bvPrP-N181X-YnK durch rekombinante Proteinexpression produziert. Nach der Aufreinigung wurden die für CuAAC oder Selenoesterkonversion verwendeten Proteinhydrazide durch Hydrazinolyse des Inteinfusionskonstrukts generiert. Jedoch wurde entdeckt, dass der Azid-Rest innerhalb von bvPrP-N181X-AzK während des Vorgangs von DTT zu einem Amin reduziert wurde. Folglich ist der Fokus auf YnK und die bvPrP-N181X Mutante übergegangen, da diese Variante eine erhöhte Expressionseffizienz aufweist. Überdies wurde der YnK Einbau und die CuAAC Reaktionsfähigkeit durch eine Konjugation zum Fluor 488 Azid demonstriert. Allerdings sind während der anschließend durchgeführten CuAAC Reaktionen, um das bvPrP-N181X-YnK Hydrazid an ein Azidomannoseglykanmimetikum zu konjugieren, Monitoring- und Niederschlagsprobleme aufgetreten. Daher konnte die Produktformation nicht bestätigt werden. Darüber hinaus wurde ein zuvor hergestelltes bvPrP-WT Hydrazid in einen Selenoester konvertiert und an ein GPI-Ankermimetikum ligiert um das bvPrP-GPI Produkt zu erhalten.